划重点

     天然煅烧骨修复材料（骼瑞）对颅骨缺损修复和引导骨再生有明显促进作用，富血小板纤维蛋白（PRF）可显著促进骼瑞对骨缺损修复疗效，联合治疗对骨缺损修复有良好的应用前景。

基本信息

关键词：天然煅烧骨；富血小板纤维蛋白；颅骨缺损；骨移植；疗效

作者：陈铁楼 ，张新海，许兵 ，徐东升，王世峰，秦卫民，刘进 ，王海彗，王晓熙，任正波

作者单位：海军军医大学第一附属医院全军口腔中心牙周科， 上海(200081)；海军军医大学第一附属医院精准医学中心， 上海(200081)；同济大学化学系，上海(200081)；上海宝山区中西医结合医院口腔科，上海(200081)；海军军医大学海军医学研究所高气压和生理重点实验室，上海(200081)；海军军医大学第一附属医院病理科，上海(200081).

刊名：口腔医学

年，卷(期)：2018年11月第38卷第11期

所属期刊栏目：论著

分类号：R782.4

基金项目：上海市卫计委面上项目(20134418)；中国人民解放军总后勤部面上项目(CHJ13J035)

页数：6

页码：970-975

doi：10.13591/j.cnki.kqyx.2018.11.003

摘要

目的  探讨富血小板纤维蛋白（Platelet rich fibrin，PRF）和天然煅烧骨（Calcined natural bovine bone ，CBB）对颅骨缺损修复疗效，为骨缺损修复提供依据。

方法  选18只成年兔在颅骨左右侧分别制作10mm直径大小圆形骨缺损，分为实验1组(植入CBB)、实验2组(植入PRF和CBB)和对照组(不植骨)。在术后4周、12周、20周取颅骨标本，分别行甲苯胺蓝染色、四环素荧光染色、影像学CT测定各组骨缺损区新骨形成面积、成骨速度、移植物吸收和骨密度值。

结果  在术后４周、12 周和20周时实验1组和实验2组新骨形成速度、成骨面积、成骨钙化程度及骨密度值均大于对照组；实验2组成骨面积和骨密度大于实验1组（P<0.05），中央网孔内成骨明显；对照组在12周和20周新骨形成明显减少。  

结论  天然煅烧骨修复材料（CBB）对颅骨缺损修复有明显疗效，富血小板纤维蛋白（PRF）可促进CBB对骨缺损修复作用，可能与PRF的骨诱导作用有关。

前言

  口腔颌面部骨缺损发病率较高，如牙周炎引起的骨缺损是牙齿缺失的主要原因，而各种创伤引起的颌面部骨缺损，更直接影响人体健康功能和美观， 因此骨缺损的修复一直是研究热点。由于自体骨来源受限，而去除了有机成分的异种骨修复材料降低了免疫排斥反应，且来源较广，受到了广泛青睐。 天然煅烧骨（Calcined natural bovine bone ，CBB）有效成分为羟基磷灰石，具有良好的骨传导能力，被广泛应用于临床^[1] ，研究发现，国产CBB修复材料（ 骼瑞骨粉）对动物骨缺损修复有一定作用^[2]；Dohan等^[3]发现富血小板纤维蛋白（Platelet rich fibrin，PRF）可促进骨再生，对骨缺损修复有治疗作用，与PRF中富含血小板和生长因子有关。但有关PRF联合CBB对骨缺损修复作用及机制尚缺乏有效证据。因此本文选取CBB联合PRF用于实验性骨缺损修复，以探讨其在骨缺损修复中疗效，为其临床应用提供依据。

资料和方法

1.1  实验材料及仪器

       天然煅烧骨修复材料（CBB）(骼瑞，陕西瑞盛生物科技有限公司)，便携式高速涡轮牙钻机（上海品瑞医疗器械设备有限公司），CT检测系统(Definition Flash X射线电子计算机断层扫描系统，SIEMENS，德国),Olympus IX 70荧光显微镜（奥林巴斯株式会社，日本）。

1.2  PRF 制备

       选成年新西兰兔18只，雄性，每只体质量约2.5Kg，心脏取血3mL，3000r/min离心制备PRF，用纱布轻压制成PRF膜备用。本课题所用动物和动物实验均经过海军军医大学第一附属医院伦理委员会同意。

1.3  骨缺损模型制作和分组

       每只兔用3%的戊巴比妥钠按1mL/Kg于耳缘静脉麻醉，脱毛后在头颅顶部颅骨处纵向切开皮肤， 刮除附着肌肉，暴露颅骨，在距离颅骨分界线1-2mm处，用便携式高速涡轮牙科钻滴水降温下切割全层颅骨形成直径为10mm圆形双皮质骨缺损（勿损伤脑膜），每一动物制作左右两个骨缺损。将36个骨缺损分为3组，每组12个缺损。实验1组（骨缺损处植入CBB骨粉）、实验2组（骨缺损处植入CBB，在其上覆盖PRF膜）和对照组（不植骨），严密缝合伤口（图1）。术后每只动物每日肌肉注射80万单位青霉素，连用5d。

图1 手术观察，骨缺损及植入骨粉照片

1.4  CT观察骨缺损处骨密度

      在术后4周、12周、20周，每组各处死2只动物取颅骨标本，用CT对各时间点骨缺损标本行图像扫描，对扫描图像骨缺损区各测定5个区域骨质CT值，用以代表骨密度，比较各组不同时间骨密度CT值差异。

1.5  甲苯胺蓝组织学观察

       在术后4周、12周和20周每组各处死2只动物，处死前3d和10d分别按40mg/Kg剂量肌肉注射四环素（30g/L）。动物处死后取实验部位颅骨（行CT拍摄后），常规4%多聚甲醛固定24h，一部分标本不脱钙作荧光显微镜观察；另一部分标本10%盐酸脱钙，石蜡包埋，行甲苯胺蓝染色，对切片用HPLAS-1000高清晰度病理图文分析系统对甲苯胺蓝染色切片测定新骨形成面积，新骨形成面积百分比=新骨形成面积¸测定区域面积。在每张切片的原缺损区随机选取3个100倍视野计数，计算新骨形成面积百分比。

1.6  荧光显微镜观察

       在术后4周、12周和20周每组各处死动物取颅骨标本，4%多聚甲醛固定24h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明， 甲基丙稀酸甲酯浸透包埋，用Leica SP 1600切片机切片，荧光显微镜观察，比较两组不同时间的差异。

1.7  统计学分析

       用SPSS 14.0软件进行统计学分析，术后4周、12周和20周时两组间的成骨面积、CT值差异采用t检验和方差分析，P<0.05为有统计学意义。

结果

2.1 各组骨缺损区骨密度CT值改变

        实验2组和实验1组在术后4周、12周和20周时骨密度比对照组明显升高（P<0.01）（图2），实验2组在术后4周、12周和20周时骨密度比实验1组明显升高（表2）。

2.2 各组甲苯胺蓝染色比较

        在术后4周时，实验1组和实验2组可见移植材料，边缘网孔内以纤维结缔组织为主，有少许骨样组织，骨样组织周围可见破骨细胞和成骨细胞，实验2组比实验1组成骨活跃；对照组为纤维结缔组织，未见新骨或骨样组织形成。

a:对照组12周，b:实验1组12周；c:实验2组20周；d:实验1组20周

图2  骨缺损区CT观察

   在术后12周，实验1组旧骨周围有新生骨样组织，在边缘网孔内有较多新生骨，高倍镜下，见骨样组织逐渐骨化，骨陷窝内有骨细胞，新生骨表面有成骨细胞，中央网孔未见明显骨形成；实验2组，纤维组织周围有较多新生骨形成，新生骨表面有较多成骨细胞排列，骨移植材料部分吸收，边缘网孔内新骨形成显著大于实验1组。 对照组边缘网孔内有少许新骨形成，中央为纤维结缔组织（图3①②③）。

        在术后20周，实验1组移植材料多数吸收，边缘网孔内充满大量新生骨或骨样组织，边缘网孔内新生骨和骨样组织向中央网孔延伸。实验2组边缘网孔和中央网孔内均有大量新生骨和骨样组织，移植材料吸收较多；对照组在旧骨边缘纤维网孔内有少部分新骨或骨样组织，中央网孔未见新骨和骨样组织（图3④⑤⑥）。

①:实验1组12周，旧骨边缘新骨形成;②:实验2组12周，纤维组织周围有较多新骨形成;③:对照组12周，旧骨附近很少骨样组织;④:实验1组20周，旧骨附近骨形成明显;⑤:实验2组20周，中央网孔和边缘网孔成骨连成片;⑥:对照组20周，边缘纤维网孔中有部分骨形成（Bone为旧骨，NB:新骨；F:纤维；↙:成骨细胞）

图3   各组甲苯胺蓝染色表现（ ×400）

2.3   各组新骨形成面积比较

        术后4、12、20周时实验1组、2组和对照组新骨形成面积所占百分比明显增加，在术后4周、12周和 20周时实验1组新骨形成面积明显大于对照组，实验2组新骨形成面积明显大于实验1组（表1）。

2.4   各组在光镜和荧光视野下改变

        在术后4周，实验1组和2组植入体网孔内可见较强的块状黄色的荧光标记物，未见明显吸收，移植物周围有纤维组织；实验2组荧光比实验1组明显增强；对照组纤维条索中有少许钙化黄色点状物（图 4 ①④⑦）。

        在术后12周，实验1组和2组网孔内有黄色条索状板块或空隙，显示为骨移植物部分吸收，网孔周围及板块荧光标记明显；实验1组边缘网孔内及周围片状标记为主，荧光强。 实验2组中央和边缘网孔内均有片状荧光标记增多，边缘网孔内黄色条状标记明显；对照组在边缘网孔周围有条索状较弱的黄色，中央纤维网孔内未显色（图4②⑤⑧）。

       在术后20周，实验1组边缘纤维网孔及周围黄色向中央扩展明显，在近中央区可见少许条索状黄色，面积扩大；实验2组中央网孔和边缘网孔连成片状或块状，均有大量钙化黄色片状新骨，荧光强度及面积明显增大，移植物多数吸收被新骨代替，荧光强度大于实验1组；对照组边缘网孔内有较弱黄色条索状或片状钙化区，中央网孔黄色荧光不明显。荧光染色显示实验1组和实验2组钙化面积和强度明显大于对照组，实验2组钙化强度和成骨面积较大，钙化时间较早（图4 ③⑥⑨）。

①:实验1组4周；②:实验1组12周；③:实验1组20周；④:实验2组4周；⑤:实验2组12周；⑥:实验2组20周；⑦:对照组4周；⑧:对照组12周；⑨:对照组20周（F:纤维；NB:新骨；Ca:钙沉积）

图 ４  各组同一视野在光镜和荧光下表现（  ×100）

讨论

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